цифічного. Хроматографія білків В
Як вже зазначалося, способи розділення білків, засновані на відмінностях у їх фізико-хімічних властивостях, не можуть бути високоспеціфічнимі. З цієї точки зору набагато перспективніше препаративні методи, які базуються на функціональних відмінностях білків. Для безлічі білків, включаючи ферменти, їх інгібітори, транспортні білки, імуноглобуліни, регуляторні білки, токсини, рецептори, - найголовніша функціональна риса полягає в здатності вибірково зв'язувати ті чи інші ліганди - субстрати, коферменти, аллостерічеськіє ефектори, антигени і т.п.
Таке зв'язування по суті своїй досить специфічно, і це властивість різко виділяє той чи інший білок з безлічі інших. На використанні функціонально обумовленої здатності білків оборотно зв'язуватися з відповідними лігандами і заснований метод афінної , або біоспеціфічгсгой. хроматографії.
Для синтезу афінного сорбенту відповідає специфічності даного білка ліганд (субстрат або його аналог при хроматографії ферменту) приєднують до інертної матриці так, щоб можливо менше торкнутися ті елементи його структури, які безпосередньо беруть участь у взаємодії з білком. Іноді ліганд прямо вводять в реакцію з функціональними групами на поверхні матриці, проте чаші їх з'єднують через проміжну ланку ("Вставку", "ніжку" і т.п.), щоб віддалити ліганд від матриці і зменшити просторові перешкоди для його зближення з білком.
До кожного з елементів структури афінного, сорбенту пред'являються певні вимоги. Матриця повинна бути інертною і не створювати стеріческіх перешкоди для білка. Найчастіше в якості матриці використовують мікропористі гелі, утворені поперечно-зшитими гідрофільними полімерами, наприклад похідне агарози - сефароза, синтетичні полімери або неорганічні носії макропористі похідні кремнезему - силікагель або скло. Приєднання лігандів до сефарозе (безпосередньо або через вставку) зазвичай проводять, активуючи її бромцианом . бромціан (сильна отрута!) В шпаринкою середовищі реагує з гідроксильними групами сефарози, утворюючи досить активний ефір ізоціанової кислоти:
В
Останній взаємодіє потім з аміногрупами ліганду L або "Вставки" з утворенням похідного ізоиочевнни, яке є сильною основою і в звичайному діапазоні рН песет позитивний заряд:
В
Таким чином, приєднання ліганду до сефарозе, активованої бромцианом, одночасно створює на матриці еквівалентне змісту ліганда число катіонних груп. Отже, такий сорбент крім біо-специфічного зв'язування білка лігандом може проявляти властивості аніоніта, що необхідно враховувати при його використанні.
Відомі й інші способи приєднання лнгандов до матриці, однак в кожному випадку слід враховувати зміни в характері носія, супроводжуючі реакцію з лігандом, а також більшу чи меншу нестійкість утворилася зв'язку, яка іноді може викликати поступову "Витік" ліганду. Наприклад, ізомочевіна може перетворюватися на похідне гуанідину в присутності значних концентрацій первинних амінів або аміаку, що тягне за собою відщеплення ліганду. p> Складніше вимоги, пропоновані до ліганду. Він перш все повинен досить сильно взаємодіяти з білком. Так, прийнято вважати, що для отримання сорбентів, призначених для виділення ферментів, в якості лігандів можуть бути використані такі інгібітори або аналоги субстрату, які мають константу інгібіровавія (субстратную константу), тобто константу дисоціації фермент - ліганд, не гірше 10 -4 М. При цьому враховується, що приєднання ліганду до матриці погіршує (тобто підвищує) константу інгібування принаймні на один порядок.
При підборі лігандів для афінної хроматографії ферментів доводиться змінювати структуру субстрату, щоб запобігти можливість його перетворення ферментом в продукт, наприклад, розщеплення пептидного ліганда, якщо йдеться про хроматографії протеїназ. Очевидно, що сорбент, що містить в як ліганд істинний субстрат, буде трансформований при першому ж контакті з ферментом і виявиться непридатним.
При пропущенні розчину, що містить складну суміш білків, інших біополімерів, низькомолекулярних сполук, солей, пігментів тощо, через біоспецифічного сорбент, побудований за описаною вище схемою, лнганд утворює комплекс тільки з тим білком, який має участо до зв'язування, комплементарний структурі ліганду. У результаті саме цей білок утримується аффинной колонкою, тоді як всі інші компоненти суміші проходять через неї не затримуючись.
Після промивання колонки для видалення неспецифически утримуваних домішок білок елююють, змінюючи склад протікає через колонку розчину так, щоб послабити взаємодія білка з лігандом. Для цього вдаються до зміни рН, додають до елюентом неорганічні солі, органічні розчинники. Всі ці фактори, впливаючи на структуру зони зв'язування лігвнда і пригнічуючи від слушні види білок-ліг видних взаємодій, наприклад іонні зв'язку та гідрофобні контакти, забезпечу...
