). Існує ще кілька методів конструювання ДНК-зондів для кількісної ПЛР.
Методологія ТаqМаn передбачає синтез флуоресцентних ДНК-зондів, специфічних до середньої частини амплікону (між праймерами) і мають на кінцях дві мітки. Одна з них - флуоресцентна молекула, інша - молекула-гаситель цієї флуоресценції. Таq-полімераза в ході ПЛР НЕ тільки добудовує нуклеотидну ланцюжок, але і руйнує пов'язаний флуоресцентний зонд. При цьому флуоресціююча мітка виходить у вільний стан, звільняючись від впливу гасителя. Тому інтенсивність флуоресценції в міру ампліфікації продуктів ПЦР зростає пропорційно числу амплікон і, відповідно, числу копій вихідної ДНК. Спеціальний прилад, що є гібридом термоблока-ампліфікатора і флуориметра, здійснює регулярні заміри флуоресценції в кожній пробірці (принцип геаl-timе-ПЛР). В результаті після 20-40 циклів ПЛР для кожного зразка отримують індивідуальні криві. За калібрувальним кривим з контрольними зразками можливо обчислити, скільки копій шуканого гена міститься в досліджуваному зразку.
Важлива особливість проведення ПЛР флуоресцентним методом полягає в тому, що пробірки з ПЛР-сумішшю не потрібно відкривати при обліку результатів. Завдяки цьому зменшується вірогідність забруднення приміщень продуктами ампліфікації і відпадає необхідність у виділенні спеціальних робочих зон для проведення електрофорезу.
Типові помилки при діагностиці методом ПЛР
Дедалі більшого розвитку набуває лабораторна діагностика на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) завдяки своїй швидкості і високої чутливості. Однак, незважаючи на простоту і зручність методу, існує ряд умов, невиконання яких може призвести до отримання недостовірного або помилкового результату.
Простий на перший погляд метод має ряд "Підводних каменів", з якими так чи інакше доводиться стикатися практично кожному фахівцю лабораторії. До різних помилок можуть призводити як відсутність досвіду у використанні даної методики, так і стереотипи мислення персоналу, який раніше працював в біохімічних або бактеріологічних лабораторіях, де інші вимоги до роботи. У результаті таких помилок можуть бути отримані хибнопозитивні, хибнонегативні або недостовірні результати аналізів.
З точки зору отримання хибнонегативного або ложноположительного результату особливо небезпечні помилки, контроль яких неможливо здійснити під час проведення ПЛР-аналізу, - перш за все, пов'язані з порушенням правил взяття, зберігання і транспортування клінічного матеріалу. Однак при діагностиці можуть допускатися й інші помилки, які можуть бути не помічені співробітником КДЛ при аналізі результатів.
Всі помилки, що допускаються в лабораторній практиці, можна розділити на три класи:
~ помилки преаналітичного етапу;
~ помилки аналітичного етапу;
~ помилки постаналітіческой етапи. p> 1.Ошібкі преаналітичного етапу ПЛР-діагностики
Операції преаналітичного етапу ПЛР-діагностики в...
