ультивують на спеціальному середовищі, на якій можуть рости лише мутанти цих штамів, у яких відбулася мутація від ауксотрофності по гістидину до прототрофності. Без зовнішніх впливів такі мутації відбуваються з низькою частотою. Якщо в середу культивування ввести хімічний мутаген, то частота мутацій значно збільшується, що реєструється по числу колоній мікроорганізмів, що виросли на даній селективної середовищі. Підготовка культури та досліджуваних препаратів:
Культуру з косяка переносили петлею в 5 мл ГПС і інкубували при 37 о С. При вирощуванні штамів, несучих плазмиду рКm 101, у ДПС вносили ампіцилін в концентрації 50мкг/мл.
У день постановки експерименту 5мл нічний культури переносили в 20мл свіжого LB-бульйон і інкубували з примусовою аерацією при 37 о С протягом 2 - 2.5ч. Потім культуру переносили в стерильні центрифужні пробірки і центрифугували 20 хв при 5000 об/хв. на центрифузі (MPW - 310, Польща). Осад ресуспендували в 0,02М фосфатному буфері або розчині сольового концентрату, розведеному 1: 4. Розчини досліджуваних препаратів готували у стерильній дистильованій воді або диметилсульфоксиде (ДМСО). Розчини препаратів готували з таким розрахунком, щоб при внесенні в суміш 0,1 мл розчину доза препарату на чашку відповідала б досліджуваної.
Проведення експерименту:
. У стерильні чашки Петрі розливали нижній агар.
. У пробірки розливали 0,6% верхній агар по 3 мл з мікродобавками біотину і гістидину і ставлять на водяну баню при температурі 45 о С.
. У верхній агар вносили 0,1мл бактеріальної суспензії, 0,1 мл досліджуваного з'єднання.
Запропоновано наступна система оцінки з'єднань на мутагенну активність (Фонштейн з співавт., 1985):
Якщо число колоній-ревертанти в досвіді і контролі достовірно розрізняється менш ніж в 2.5 рази, то робиться висновок про відсутність мутагенної активності. Якщо фіксують перевищення від 2.5 до 10 раз, то робиться висновок про наявність мутагенної активності. Перевищення від 10 до 100 разів говорить про середню мутагенної активності досліджуваного з'єднання. Якщо фіксують перевищення більш ніж у 100 разів, - речовина володіє сильною мутагенною активністю.
2.1.5 Бактеріальні тест - системи для визначення антимутагенних ефектів з'єднань природного походження
Для вивчення антимутагенних властивостей сполук рослинного походження використовували модифікації тесту Еймса: Тестерна бактерії попередньо інкубували з різними концентраціями біокомплексів і мутагеном азидом натрію протягом 20 хвилин інкубували з примусовою аерацією при 37 о С для оцінки біоантімутагенного ефекту, а потім у верхній агар додавали біотин з гистидином. Антимутагенний ефект досліджуваного з'єднання оцінювали, порівнюючи число колоній прототрофов, індукованих мутагеном без обробки клітин розчином досліджуваних сполук, і після преінкубаціі клітин з розчином і мутагеном. Антимутагенний ефект розраховували за формулою:
антимутагеном ефект (%);
Де a -число His + ревертанти в позитивному контролі,
b - чіслоHis + ревертанти в дослідному варіанті,
c- чіслоHis + ревертанти в негативному контролі.
Згідно Negi зі співавторами [Negi etal., 2003], інгібування мутагенного ефекту менше ніж на 25% свідчить про слабку, від 25% до 40% про середню, вище 40% - про сильне антимутагеном ефекті.
. 1.6 Статистична обробка результатів
Статистичну обробку результатів проводили з використанням стандартних математичних методів в програмі Microsoft Excel. Групу даних вважали однорідною, якщо середньоквадратичне відхилення s в групі не перевищувало 15%. Різниця між групами вважали достовірним при Р? 0.05.
2.2 Результати досліджень та їх обговорення
. 2.1 Визначення токсичної дії екстрактів лікарських рослин Chelidonium majus L., Cichorium intybus L., Tussilago farfara L. на виживаність штаму Salmonella typhimurium TA 100
Результати аналізу токсичності досліджуваних препаратів на штамі S. typhimurium ТА100 представлені на таблиці 1.
Таблиця 1 Вплив алкалоїдів, водного екстракту чистотілу (ВЕЧ, ВЕЧ - 1, ВЕЧ - 2), на виживаність штаму S.typhimurium TA 100
ВаріантиКолічество колоній/чашкуВижіваемость,% Контроль ДМСО31 ± 2,5100Алкалоіди13,5 ± 0,443,5Ал - 116,5 ± 0,953Ал - 226,5 ± 2,186,4Контроль (діст.Вода) 198 ± 9, 3100ВЕЧ150 ± 8,075ВЕЧ - тисяча сто п'ятьдесят шість ± 8,278ВЕЧ - 2 160 ± 8,380
Як видно з таблиці 1, водний екстракт чистотілу великого не чинив істотного токсичної дії на штам Salmonella typhimurium TA 100 відсоток ви...
