1мл на 1 л середовища. Стерилізація проводілась аналогічно середовищі МПА.
У якості єдиного джерела вуглецю використовували сахарозу (С 12 Н 22 Про 11) або гексадекан (С 16 Н 34). Використання сахарози обумовлено її застосуванням як С-субстрату при можливому подальшому масштабуванні культивування в ферментерном комплексі ОКА - 01. Всі вуглеводні проходили автоклавирование по вище описаною методикою.
Чисті культури бактерій вирощувалися на скошеному мясопептонном Араго (склад представлений раніше).
.3 Культивування мікроорганізмів
Культивування бактерій вироблялося в плоскодонних колбах, з початковим обсягом середовища 150 мл і внесеним в середу інокуляти об'ємом 0,75 мл. Процес культивування протікав на орбітальній гойдалці (Biosan multi-shaker psu - 20), при температурах культивування t °=30-33 ° С, t °=20-23 ° C і частоти обертання 120 об/хв. Мікроорганізми росли в живильному середовищі мінімального складу мінеральних солей (склад представлений в розділі Живильні середовища ) і сахарозою як джерело вуглецю, впродовж 4 доби.
2.4 Метод визначення концентрації мікроорганізмів
Метод визначення оптичної густини (ОГ) культури, як показник концентрації клітин і кількості біомаси в досліджуваному зразку [Рубан, 1976; Режими роздільного і ..., 2 008]. Виміри проводилися на колориметрі фотоелектричному концентраційному КФК - 2МП, для перерахунку ОП в кількість клітин використовувалися калібрувальні графіки.
Гравіметричний метод визначення абсолютно сухої біомаси, полягав у центрифугировании нативної рідкої культури протягом 30 хвилин, з подальшим акуратним відділенням супернатанта, витримуванням центріфугірована біомаси в сушильній шафі протягом трьох діб і зважуванням сухої маси бактерій на вагах другого класу точності (похибка 0,0005 г) з вирахуванням маси центрифужних пробірок.
2.5 Визначення концентрації біомаси при культивуванні на рідкому поживному середовищі
Використовувалася вдосконалена методика Brown для визначення абсолютно сухої ваги (АСВ) біомаси [Brown, Punchik, Cooper, 1997]. Під зважені з точністю до 0,0001 г чисті центрифужні пробірки ємністю 12 мл поміщали 10 мл досліджуваної суспензії клітин. Пробірки центрифугували 30 хв при 3500 об/хв. За допомогою пастерівської піпетки відбирали чистий супернатант, або, у разі спливання частини біомаси. У пробірку додавали 9 мл дистильованої води, клітини ресуспендіровалі, потім центрифугували повторно. [Методи загальної бактеріології, 1983]. Після трьох циклів відмивання дистильованою водою, згідно з правилами визначення концентрації біомаси при культивуванні на вуглеводнях [Marino, Karp, Cooper, 1998], клітини промивали органічним розчинником для видалення залишків вуглеводневої субстрату, адсорбована на поверхні мікроорганізмів і посуду. Як розчинник використовували гексан. Після видалення гексану, клітинну біомасу сушили безпосередньо в центрифужной пробірці до АСВ. Пробірки зважували, на підставі різниці між масами вихідної порожній і заповненої висушеними клітинами пробірок судили про концентрацію біомаси. У разі присутності в рідкій мінеральному середовищі нерозчинного осаду солей, з отриманої маси вичитали масу сухих речовин відповідного обсягу неінокулірованного контролю.
В експериментах по оптимізації складу живильного середовища для напрацювання біомаси клітин, культивування велося безпосередньо в центрифужних пробірках на орбітальній гойдалці при частоті обертів 200 об/хв.
2.6 Метод кількісного обліку мікроорганізмів за допомогою лічильної камери Гаряева
Рахункова камера Гаряева являє собою предметне скло, розділене борозенками на частини. Центральна частина скла нижче бічних на 1/10 мм, на ній нанесена сітка. Площа великого квадрата сітки дорівнює 1/25 мм 2, площа малого квадрата - 1/400 мм 2. Покривне шліфоване скло притирають до камери до появи райдужних смуг. Пастерівської піпеткою вводять в камеру досліджувану бактеріальну суспензію. Клітини мікроорганізмів підраховують з об'єктивом 40х в фазово-контрастному мікроскопі. Обсяг стовпа рідини над кожним квадратом становить 1/250 мм 3 [Піменова, Гречушкіна, Азова, 1971].
Кількість клітин в 1 мл вихідної суспензії обчислюють за формулою:
M=a ? 100 0/h ? S, де (1)
М - число клітин в 1 мл суспензії;
а - середнє число клітин в квадраті сітки;
h - глибина камери в мм; <...
