3. На моделі ферменту всередині щілини були розміщено три залишку цукру (що позначаються як залишки D, E і F); кожний наступний цукор приєднувався таким чином, щоб його конформація була такою ж (наскільки це можливо), як і у перших трьох цукрів. У складі модельного комплексу всі залишки цукрів реалізують ефективні Нековалентні взаємодії з бічними і пептидними групами амінокислотних залишків, що утворюють щілину.
При ідентефікаціі каталітичних груп природно було зосередити увагу на тих з них, які в фермент-субстратном комплексі перебувають близько розщеплюваного гликозидной зв'язку і можуть служити донорами або акцепторами протонів. Виявилося, що по одну сторону від розщеплюваного зв'язку, на відстані? 0,3 нм (від кисню гликозидной зв'язку), знаходиться карбоксильная група Glu - 35, а по іншу (на такій же відстані) карбоксильная група Asp - 52, оточення їх сильно розрізняється. Glu - 35 оточена гідрофобними залишками; можна припускати, що в оптимумі рН ферменту ця група знаходиться в неіонізованому стані. Оточення Asp - 52 виражено полярне; її карбоксильная група бере участь в якості акцептора водню в складній мережі водневих зв'язків і функціонує, ймовірно, в іонізованому стані.
Запропоновано наступна схема каталітичного процесу при гідролізі олігосахариду. Неіонізовану карбоксильная група Glu - 35 виступає в якості донора протона, поставляючи його гликозидная атому кисню між атомом С (1) цукру D і атомом С (4) цукру Е (стадія загального кислотного каталізу); це призводить до розриву гликозидной зв'язку. У результаті залишок цукру D переходить у стан карбкатиона з позитивно зарядженим атомом вуглецю С (1) і приймає конформацію напівкрісла. Негативний заряд карбоксилатні групи Asp - 52 стабілізує карбкатион. Залишок NAG 2 (цукру E + F) дифундує з області активного центру. Потім в реакцію вступає молекула води; її протон переходить до Glu - 35, а ВІН - -группа до атома С (1) залишку D (стадія основного каталізу). Залишок NAG 4 (цукру А + В + С + D) йде з області активного центру, і фермент повертається в початковий стан.
Рибонуклеаза (РНКаза) підшлункової залози бика гідролізує Межнуклеотидная зв'язку в РНК близько пірімілінових ланок, які при цьому залишаються етерифікованих по 3 -становище. Фермент поряд з іншими нуклеазами широко використовується при аналізі структури РНК.
РНКаза утворена одного поліпептидного ланцюгом, що містить 124 амінокислотних залишку, а її молекулярна маса дорівнює 13680; в молекулі є чотири дисульфідні зв'язки. РНКаза є першим ферментом, для якого була встановлена ??первинна структура.
На підставі результатів дослідження ренатурації рибонуклеази К. Афінса вперше чітко сформулював уявлення про те, що просторова будова білка визначається його первинною структурою.
У 1958 р Ф. Річардс показав, що в певних умовах субтілізін розщеплює в РНКаза пептидний зв'язок Ala - 20 - Ser - 21. Утворені фрагменти були назві S-пептидом (залишки 1-20) і S-белком (залишки 21-124); за рахунок нековалентних взаємодій фрагменти утворюють комплекс, названий РНКази S. Цей комплекс має майже повної каталітичної активністю нативного ферменту; в ізольованому вигляді S-пептид і S-білок неактивні. Далі було встановлено, що синтетичний пептид, ідентичний по послідовності фрагменту S-пептиду, що містить залишки з 1 по 13, відновлює активність S-білка, проте більш короткий пептид, що містить залишки з 1 по 11, такою здатністю не володіє. Отримані дані дозволили зробити висновок про те, що відповідні залишки His - 12 або Met - 13 (або обидва цих залишку) входять до активний центр.
При дослідженні впливу рН на активність РНКази була з'ясована важлива роль функціональних груп білка з рК 5,2 і 6,8; це дозволяло припускати участь в каталітичному процесі залишків гістидину.
При Карбоксилювання РНКази іодацетатом при рН 5,5, тобто в умовах, при яких переважно відбувається модифікація залишків гістидину, наблудалась повна втрата активності; модифікований фермент містить 1 моль карбоксіметільних груп на 1 моль білка. У результаті утворюються дві монокарбоксіметіленовие форми ферменту. В одній формі карбоксіметілірованним є залишок His - 12, а в іншій - His - 119. Переважно модифікувався His - 119.
Ці дані дозволили припустити, що His - 12 і His - 119 знаходяться в активному центрі і що модифікація одного з них перешкоджає модифікації іншого.
У результаті рентгеноструктурних досліджень було з'ясовано просторову будову РНКази S і комплексу РНКази S з інгібіторами. Молекула має форму нирки, активний центр локалізований в поглибленні, де знаходяться залишки His - 12, His - 119 і Lys - 41.
Гідроліз відбувається в результаті сполученого дії залишків His - 12 і His - 119, що здійснюють кислотно-основний каталіз. На...
