з субстратом (Комплекс Міхаеліса-Ментен), Р - продукт. Концентрація субстрату [S] 0 буде пропорційна u0 тільки за умови, коли [S] 0! Km. Тоді
[S] 0 = U0Km/kкат [E]
Отже, верхня межа визначуваних концентрацій субстрату обмежена величиною константи Міхаеліса-Ментен (Km). Нижня межа визначуваних концентрацій субстрату визначається тією величиною u0, яка може бути зафіксована з допомогою використовуваного для спостереження інструментального методу, причому величина u0 тим вище для одного і того ж значення [S] 0, чим вище kкат і [E]. Таким чином, використання високоактивного ферменту (велике значення kкат) і підвищення його концентрації в реакційній суміші можуть суттєво знизити межу виявлення субстрату.
Кілька інші кінетичні закономірності слід враховувати при визначенні тих речовин, які є ефекторами ферментів.
Для контролю початкової швидкості ферментативного процесу або концентрації продукту реакції можуть бути використані практично будь-які доступні досліднику фізико-хімічні методи. Найбільш часто застосовують фотометричні методи індикації. При цьому в якості індикаторних часто використовують, наприклад, каталізуються пероксидазою та іншими оксидазами (ферменту, що каталізує окислювально-відновні реакції), а також гідролазами (каталізує реакції гідролізу) реакції утворення забарвлених продуктів. Виключно високою чутливістю відрізняються хемілюмінесцентні методи, що дозволяють контролювати швидкість ферментативних реакцій за участю, наприклад, люціферази. Різні електрохімічні методи (потенціометрія, амперометрія) найбільш зручні для контролю швидкості реакцій, що протікають з поглинанням або виділенням протонів, а також окислювально-відновних процесів, супроводжуються поглинанням кисню, освітою Нои т.д. Ферментні електроди, в яких фермент механічно або ковалентно включають в напівпроникну полімерну мембрану, яка покриває електрод, дозволяють специфічно визначати різні органічні і неорганічні сполуки без введення в аналізований розчин додаткових реагентів.
До теперішнього часу розроблено велике число високочутливих і селективних ферментативних методів визначення субстратів і ефекторів ферментів: неорганічних (іонів металів, аніонів) і органічних (N-, S-, P-, O-містять) з'єднань. При цьому можна виділити ферменти, що дозволяють визначати цілий клас сполук, або частину цього класу, або індивідуальне з'єднання. Так, за допомогою алкогольдегідрогенази можна визначати спирти (Субстрати цього ферменту), алкогольоксидази - первинні спирти, арілалкогольоксідази - ароматичні первинні спирти. Слід зазначити, що методи визначення ефекторів, хоча і менш селективні, часто більш чутливі, ніж методи визначення субстратів. Так, межі виявлення багатьох органічних речовин - субстратів ферментів лежать в інтервалі 10 - 6-10 - 4 М, а органічних ефекторів - 10-11-10 - 8 М. Крім того, число ефекторів ферментів значно більше, ніж число їх субстратів, що розширює можливості ферментативних методів аналізу.
