ронтом розчинника:
= a/b,
де a - відстань від місця нанесення розчину суміші амінокислот (лінія старту) до центру плями конкретної амінокислоти; - шлях, пройдений розчинником від лінії старту до його фронту закінчення хроматографії, мм.
Для кожної амінокислоти характерно своє значення Rf, яке залежить від сорту хроматографічного паперу, системи розчинників, температури, рН середовища і т.д.
Реактиви. Фенол, насичений водою *; нингидрин, 0,2%-ний розчин в ацетоні. p align="justify"> Обладнання. Термостат, відрегульований на температуру 37-38 В° С; сушильну шафу, відрегульований на температуру 100-105 В° С і має поперечини з гачками для підвішування хроматограмм; великі пробірки (діаметр 2,0-2,5 см, довжина 18-20 см) з щільно підігнаними пробками і штатив для них; смужки хроматографічного паперу (ленінградська, краще марки В«швидкаВ», 12х150 мм); простий олівець і лінійка; голка з ниткою; микропипетка; чашка Петрі або пульверизатор; пінцет; ножиці; піпетка місткістю 5 мл.
Матеріали. Розчин суміші L-аланіну, лейцину і глутамінової кислоти, 0,04 моль/л. p align="justify"> Метод заснований на різній швидкості пересування амінокислот по паперу залежно від коефіцієнта розподілу їх між нерухомою (вода з домішкою фенолу) і рухомого (фенол, насичений водою) фазами розчинника.
Хід визначення. Беруть пінцетом за кінець смужку паперу (не торкатися паперу пальцями!), Проколюють його голкою з ниткою, яку зав'язують петлею довжиною 5-6 см. На протилежному кінці смужки, відступивши від краю 2 см, проводять простим олівцем лінію старту і в центрі її окреслюють гурток діаметром 3-4 мм для нанесення розчину суміші амінокислот.
Смужку укладають на лежачі скляні пробірки і наносять 0,2 мл розчину суміші амінокислот, але не відразу, а порціями. Після нанесення кожної порції пляма підсушують, щоб воно не розпливалося за межі окресленого олівцем гуртка. p align="justify"> У суху пробірку за допомогою піпетки вносять 2 мл фенолу, насиченого водою (при роботі з фенолом дотримуватися обережності: викликає опіки! Чи не насмоктувати його в піпетку ротом!), стежачи за тим, щоб не змочити стінки пробірки .
Ставлять пробірку в штатив строго вертикально. Обережно, тримаючи за нитку, опускають в пробірку смужку паперу, занурюючи її нижній кінець у розчинник не більше ніж на 2-3 мм, і закріплюють її у висячому положенні, притиснувши петлю щільно закритою пробкою (рис. 4). p align="justify"> Поміщають штатив з пробіркою в термостат (при 37-38 В° С) на 1,5 ч.
В
Рис. 4. Прилад для хроматографії (а) і хроматограмма амінокислот (б)
Потім виймають смужку, підвішують її за петлю в сушильній шафі і витримують при 100-105 В° С протягом 10 хв.
Для прояву хроматограми смужку переносять в чашку Петрі, в яку налито 15 мл розчину нингидрина, тримаючи її пінцетом, проводять через розчин і знову поміщають у сушильну шафу на 5 хв при тій же температурі.
Оформлення роботи. Замалювати в робочому стані прилад, зазначивши положення амінокислот на хроматограмі. Виміряти лінійкою відстані (у мм) a і b для кожної амінокислоти і розрахувати їх Rf. У висновку відзначити можливість поділу хроматографії на папері різних амінокислот. p> Практичне значення роботи. Хроматографический аналіз вільних амінокислот у сироватці крові, сечі та інших рідких середовищах застосовується в клініці для діагностики спадкових захворювань обміну амінокислот, патології печінки, нирок, а також при оцінці ступеня тяжкості цукрового діабету: у фармації - для контролю якості білкових гідролізатів і препаратів суміші амінокислот, а в наукових експериментах - для вивчення амінокислотного складу гідролізатів очищених білків.
2. Дослідження фізико-хімічних властивостей білків
Фізико-хімічні властивості білка визначаються особливостями його структурної організації, яка надає йому нові якості, відсутні у складових поліпептидний ланцюг мономерів. Особливості фізико-хімічних властивостей білка лежать в основі багатьох прийомів і методів, що застосовуються в клініко-біохімічних лабораторіях, фармацевтичній практиці і в експериментальній біохімії для його виділення та очищення, якісного та кількісного аналізу. br/>
Робота 4. Діаліз білків
Діаліз демонструє макромолекулярную природу білка. Як і всі високомолекулярні сполуки, білок не проникає через штучні (наприклад, целофан, пергамент та ін) і біологічні мембрани, що дозволяє використовувати діаліз як метод очищення білка від низькомолекулярних органічних і неорганічних домішок. З цією метою застосовується спеціальний прилад - диализатор (або Електродіалізатор). Найпростіший з них являє собою зроблений з целофану або іншого подібного йому матеріалу мішечок, наповнений розч...
