ином очищуваного білка і занурений у склянку з дистильованою водою. p align="justify"> Реактиви. Сульфат амонію, насичений розчин; хлорид барію, 5%-ний розчин; біуретового реактив *. p align="justify"> Обладнання. Целофан, попередньо розрізаний на шматки розміром 125х125 мм (можна застосовувати заводський діалізаторний матеріал); склянку з дистильованою водою; скляні палички; гумові колечка; штатив із пробірками; піпетки. p align="justify"> Матеріал. Розчин яєчного білка (приготування див. роботу 1) або сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на здатності мембран затримувати макромолекули білка і пропускати неорганічні іони.
Хід визначення. До 5 мл розчину яєчного білка (або сироватки крові) додають краплю насиченого розчину сульфату амонію і перемішують. Відбирають у дві пробірки по 10 крапель розчину і проробляють в одній з них біуретову реакцію, а в іншій - пробу на сульфати. При проведенні проби на сульфати додають 2-3 краплі розчину хлориду барію. p align="justify"> целофаном, попередньо замочені у дистильованої води, надають форму мішечка, який приблизно на 1/3 заповнюють досліджуваним розчином білка. Краї мішечка затискають між двома скляними паличками, які притискають один до одного за допомогою одягнутих з двох кінців гумових колечок. p align="justify"> Мешочек занурюють у склянку з дистильованою водою, поклавши затискають його скляні палички на краю склянки. Рівень рідини в мішечку не повинен бути вище рівня рідини у склянці (мал. 5). <В
Рис. 5. Диализатор в робочому стані
Через годину після початку діалізу беруть дві проби (по 10 крапель) зовнішньої рідини (діалізат). З одного боку з них проводять біуретову реакцію на білок, а з іншого - реакцію на сульфати, додаючи 2-3 краплі хлориду барію. p align="justify"> Проробляють проби на білок і сульфати з рідиною всередині мішечка.
Оформлення роботи. Результати оформити у вигляді таблиці, відзначивши знаками В«плюсВ» чи В«мінусВ» наявність реакції:
Визначувані компонентиДо діалізаПосле діалізавнешняя жідкостьвнутренняя жідкостьвнешняя жідкостьвнутренняя жідкостьБелок SO42-
У висновках відзначити, яке властивість білка демонструє метод діалізу та можливість його застосування.
Практичне значення роботи. Метод аналізу використовується для відділення низькомолекулярних органічних домішок і неорганічних іонів при очищенні білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів і т.д. в біохімічних дослідженнях або при отриманні лікувальних препаратів (наприклад, білкових). Спосіб діалізу покладений в основу роботи апарату В«штучна ниркаВ», який застосовується для очищення крові від природних низькомолекулярних В«шлаківВ» і токсичних сполук. br/>
Робота 5. Визначення ізоелектричної точки білка
Білок як амфотерний поліелектроліт містить позитивні і негативні заряди, співвідношення яких визначається кількістю кислих і основних амінокислот в його макромолекулі. Зарядженість молекули білка є одним з факторів його стійкості в розчинах, оскільки заважає злипання білкових частинок і випаданню їх в осад. На загальний заряд макромолекули білка впливає рН середовища. Для кожного білка існує значення рН, при якому сума позитивних і негативних зарядів його дорівнює нулю. Це стан білка називається ізоелектричної, а відповідне такого стану значення рН називається ізоелектричної точкою (ВЕТ). У ВЕТ розчини білків нестійкі і білки легко випадають в осад особливо у присутності водовіднімаючих речовин (етиловий спирт, ацетон і т.д.). p align="justify"> Реактиви. Оцтова кислота, 0,2 М розчин; ацетат натрію, 0,2 М розчин; етиловий спирт, 96%-ний. p align="justify"> Обладнання. Піпетки місткістю 1 і 2 мл; штатив із пробірками. p align="justify"> Матеріал. Казеїн, 0,1%-ний розчин. p align="justify"> Метод заснований на здатності розчиненого білка (казеїну) в ізоелектричній точці переходити в нестійкий стан і випадати в осад, що проявляється у вираженому помутнінні розчину. При додаванні етилового спирту (водоотнимающее засіб) процес осадження білка прискорюється. p align="justify"> Хід визначення. У шести пронумерованих пробірках готують буферні суміші з різним значенням рН. Вміст пробірок збовтують і в кожну додають по 0,5 мл розчину казеїну. p align="justify"> Приготування буферних систем для визначення ВЕТ казеїну
№ пробіркіСостав буферної суміші, млрн смесі0, 2 М CH3COOH0, 2 М CH3COONa11, 90,13,421,80,23,831,40,64,441,01,04,750,61,45,160,21,85,7
Після цього суміш в пробірках знову струшують і відзначають помутніння розчину. У кожну пробірку додають по 2 мл етилового спирту і оцінюють ступінь каламутності проб. p align="justify"> Оформлення роботи.
Результати оформити у вигляді таблиці, відзначаючи ступінь каламутності розчину до і після додавання етилов...
