навіть при негативних результатах дослідження HBsAg і анти-НВs. Антитіла до HBeAg (анти-НВе) з'являються в крові після елімінації HBeAg і завершення реплікації вірусу. До кінця 9-го тижня гострого періоду гепатиту В більш 90% хворих мають анти-НВе. В період одужання анти-НВе можуть зникати. Однак, наявність анти-НВе не є показником відсутності інфекційності конкретної сироватки крові. Показано, що у ряду хворих в ході розвитку гепатиту В (близько 10%) під впливом імунного тиску на вірус виникають мутантні форми, які уникають імунного нагляду і не елімінуються. У носіїв анти-HBe був виділений мутант, нездатний продукувати HBeAg через дефекти в області precore і одержав позначення HBeAg-негативного. Поява HBeAg-негативного мутанта призводить до прогресування ураження печінки при триваючої реплікації вірусу (наявність ДНК HBV в сироватці крові). При первинному інфікуванні HBeAg-негативним мутантом істотно зростає ризик розвитку фульминантного гепатиту. Описані маркери гепатиту В досліджуються методом ІФА. Спектр антитіл (анти-НВе, анти-НВs, анти-НВcIgM, анти-НВcIgG) і антигенів (HBsAg, HBeAg) дозволяє встановити діагноз гепатиту В і визначити стадію захворювання (таблиця 1). Недоліком даного методу є неможливість його використання при зараженні мутантними формами вірусу, при імуносупресії (хворі онкологічними захворюваннями, наркомани і т.д.) і для кількісної оцінки присутнього в організмі збудника. Вирішення цих завдань стало можливим в результаті впровадження молекулярно-біологічних методів в практику клинико-діагностичних лабораторій.
Таблиця 1. Різні поєднання серологічних маркерів інфікування вірусом гепатиту В та їх інтерпретація
HBsAgHBeAgантіНВc IgMантіНВ c суммантіНВеантіНВsHBV ДНКТрактовка результату ++++ - + Гострий гепатит В. Дикий штам + - ++ - + Гострий гепатит В. Мутантний штам + - +/- ++ -/ + дозволено гострий гепатит В.Сероконверсія. +++/- + -/+ - + Хронічний активний гепатит В +/-/+ -/+++/- +/- Хронічний інтегративний гепатит В + - + -/+ - Здорове носійство --- + -/++ - Перенесений вірусний гепатит В ----- + - Стан після імунізації
Методи генодиагностики, до яких відноситься ПЛР, істотно розширюють можливості лабораторної діагностики вірусного В, дозволяючи безпосередньо виявити збудник, встановити тканинну і внутрішньоклітинну локалізацію HBV, виявити і охарактеризувати мутантні форми вірусу, оцінити рівень віремії в перебіг захворювання, в тому числі - на тлі противірусної терапії.
В даний час існує широкий спектр діагностичних тест-систем для виявлення ДНК HBV в лабораторних умовах, заснованих на методах ПЛР - фірми Roche raquo ;, НПФ Літех raquo ;, ДНК технологія raquo ;, LCR (лігазна ланцюгова реакція) - фірма Abbott raquo ;, bDNA (метод развлетвленной ДНК зондів) - фірма Chiron raquo ;. Ці тест-системи дозволяють проводити якісне визначення наявності збудника в біологічному матеріалі: сироватці або плазмі крові, тканини печінки, мононуклеарами. Одним з варіантів якісного визначення ДНК HBV є технологія ПЛР insitu (в гістологічних зрізах), що дозволяє встановити внутрішньоклітинну локалізацію вірусу в гепатоцитах.
Єдина комерційнихя тест-система диференціальної діагностики НВеAg-негативного гепатиту В створена фірмою Abbot з використанням LCR. Істотним недоліком цієї системи є виявлення тільки однією з багатьох мутацій, що призводять до відсутності синтезу НВеAg вірусом. Виявлення всієї сукупності генетичних змін, характерних для НВеAg-негативних вірусів гепатиту В, можливо поки тільки прямим секвенуванням ПЛР-ампліфікованих фрагментів вірусного генома.
Кількісна характеристика змісту ДНК HBV в клінічних зразках важлива для оцінки ефективності противірусної терапії і має прогностичне значення для визначення хронізації HBV. При початково низькому рівні віремії (ДНК HBV менш 500 фг/мкл) відсоток хронізації гострого гепатиту В близький до нуля, при концентрації HBV ДНК від 500 до 2000 фг/мклхронізація процесу спостерігається у 25-30% хворих, а при високому рівні віремії у пацієнта (більше 2000 фг/мкл) гострий гепатит В найчастіше переходить у хронічний.
Видатні комерційні тест-системи оцінки концентрації ДНК HBV реалізують принцип конкурентного ПЛР-аналізу з подальшою гібридизаційним схемою визначення продуктів ампліфікації (фірма Roche raquo ;, НПФ Літех ). Цей підхід заснований на внесенні до клінічний зразок внутрішнього стандарту відомої концентрації, що якісно відрізняється від обумовленої матриці. Після ПЛР концентрація ДНК HBV в досліджуваному матеріалі розраховується на підставі відомої концентрації внутрішнього стандарту і співвідношення накопичення продуктів ампліфікації внутрішнього стандарту та обумовленою матриці.
На даний момент розвиток методів лабораторної діагностики гепатиту В йде за напрямом створення комерційн...
